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25/Nov/2011 probeの解離定数を求める。 I am gonna determine Kd value. 2 units/ml Bc-PLC 2/5 units/ml Bc-PLC 2/5*5 units/ml Bc-PLC 2/5*5*5 units/ml Bc-PLC 2/5*5*5*5 units/ml Bc-PLC 2/5*5*5*5*5 units/ml Bc-PLC 2/5*5*5*5*5*5 units/ml Bc-PLC 2/5*5*5*5*5*5*5 units/ml Bc-PLC 0 units/ml Bc-PLC At the same time, I am gonna determine real amount of DAG level by brigh and dyer method. 18/Nov/2011 SMの量におけるD609の影響をMDCK細胞で調べる。 Effect of D609 on SM level in MDCK cells 1)ctrl 2)SMase 3)3hour D609 incubation 4)6hour D609 incubation 5)20hour D609 incubation mCherry-lysenin conc is 50microg/ml. 1 30 3hour 4 30 6hour 6 00 20hour SMase 1 units/ml 10 min. After that, fixed. What I have to prepare is that HBSS and 3 % PFA Effect of DGAT inhibitor on DAG level in MDCK cells. 1microM A922500 was used for this experiment. 2pm Add A922500 start incubation 4pm Add A922500 start incubation 5pm DAG probe incubation. こんなかんじで 17/Nov/2011 Rat red blood cell experiment, At first, I did the experiment as follows 1)1U/ml Pc-PLC + 200times annexin V + 9*108 cell/ml result hemolysis within 4 min 2)0.1U/ml Pc-PLC + 40 times annexin V + 9*108 cell/ml result hemolysis within 5 min In this time, protocol was wrong. 3)real experiment 0.1U/ml Pc-PLC + 40 times annexin V + 9*108 cell/ml I get annexin V fluorescence but it is not for living RBL cells. At first, RBC was subjected to hemolysis, become ghost, and then become fluorescence. 4)0.1U/ml Bc-PLC + 40 times annexin V + 9*108 cell/ml RBC rarely give hemolysis and no fluorescence. And I tryed the experiment whether Bc-PLC makes DAG on the plasma membrane in RBC in a Bc-PLC conc. dependent manner. 1) 800 microl RBC (9*108 cell/ml) 2) Add DAG probe 24 microl here And 3)2microl 100 units/ml Bc-PLC was added to the 8 microl HBSS. 4)2microl of this solution was added to next tube, which has 8 microl HBSS. 5)this step is done one after another. this means that 5 time solution is gonna prepare. Next in each tube, 75 microl RBC solution was added and is incubated for 10 min @r.t. after that, fixed 6% (final 3%), and incubated for 15min. and spin down. こんな感じでやりましたよーん。 30/Oct/2011 D609の濃度 50microg/ml Offered as 5 mg (sc-201403) and 25 mg (sc-201403A) sizes Synonym O-Tricyclo[5.2.1.02,6]dec-9-yl dithiocarbonate potassium salt CAS Number 83373-60-8 Molecular Weight 266.5 Molecular Formula C11H15OS2K Purity 98% Physical Appearance Off-white solid Solubility Soluble in water (25 mg/ml) I used D609 with the concentration of 188microM 以下のものをやってみる。 Other experiments 1. living MDCK cells with alpha PMA and PMA 2. DAG probe calibration with Bc-PLC Bc-PLC 20 units/ml Bc-PLC 10 units/ml Bc-PLC 5units/ml Bc-PLC 0units/ml D609 3. fixed MDCK cells with SMase noSMase SMase SMase+D609 SMase+BcPLC 4. living MDCK cells with SMase + Bc-PLC 5. SM amount with SMase or nojirimycin 6. DAG amount with SMase or nojirimycin 111016 もう一度最後の実験 以下の実験を２回繰り返す。 それぞれについて１０個の細胞をとる。 それでanalyzeして終わり。 Thinking about biological significance, I am gonna try this experiment as follows. 1. noSMase 2. SMase 3. SMase+D609 4. SMase+BcPLC 16/June/2011 Now I started to write the papers. But I have several experiments I have to do and I want to do. 1. test if the DAG which exist already on the membrane is abolished by incubated with D609. 2. I am gonna take beautiful data of cholesterol, DMS and NB-DNJ. SMS2がPC-PLCであるか否か？とういうことに関係するのですが、 D609処理した細胞で、ライセニンで染まるかどうかという実験を過去にラボでやった人はいらっしゃいますか？ あと、SMS1およびSMS2が欠損したMEF-ZS2とSMS1もしくは、SMS2が発現させた細胞では、ライセニンで染めるとどのように違いがでますか？ こちらについては、やっているのではないかと思い聴いて見ました。 And then I want to get the PC-PLC antibody. 20May2011 I am gonna do the experiment. I don t miss to write but in the previous experiment. UV was irradiated to MDCK cells for 1 min. 30 min, 1hour 2hout later, the cells were fixed and observed. 30min there is 30% cells in which DAG probe was translocated. But not so obvious. So I am gonna do 10 min incubation after UVB irradiation. Because some papers says that 10 min is more DAG. So, 1. UVB 10min 2. UVB D609 10 min 3. No UVB And then the previous experiment that when MDCK was fixed, DAG probe localized at the plasma membrane incubated with 12.5 Bc-PLC 10 min. So, I need to play around the concentration of Bc-PLC. 4. Bc-PLC 0 microunit/ml 5. Bc-PLC 0.1 microunit/ml 6. Bc-PLC 0.5 microunit/ml 7. Bc-PLC 1 microunit/ml 8. Bc-PLC 5 microunit/ml 9. Bc-PLC 12.5 microunit/ml And then, U73122 doesn t abolish ATP-induced DAG on the outer leaflet of plasma membrane. So, I suspect PAP-induced DAG. I am gonna use the propranolol. 10. ctrl 11. D609 12. D609+ATP 13. D609+ATP+propranolol At the same time, I am gonna use the MDCK cells expressing mGluR5 and bath application of glutamate. 14. ctrl 15. glutamate 06May2011 I gonna do the experiment about DAG flip in fixed cells. A. EYFP-C1AB and DsRed B. EYFP-C1AB and DsRed with 10mM MbCD + 12.5unit/ml BcPLC C. EYFP-C1AB and DsRed with 20microM Fumonisin B1 + 12.5unit/ml BcPLC D. EYFP-C1AB and DsRed with 50nM ISP1 + 12.5unit/ml BcPLC E. EYFP-C1AB and DsRed with 6 microM DMS + 12.5unit/ml BcPLC F. EYFP-C1AB and DsRed with 100 microM NB-DNJ + 12.5unit/ml BcPLC G. EYFP-C1AB and DsRed with Bc-PLC as ctrl H. EYFP-C1AB and DsRed with PMA 28Apr2011 How to irradiate UVB (290-320nm) 1. reduce the volume of medium, DMEM 100 microl. Go to program 2. Set 10 mJoules/cm2 for 1min 3. replace the medium with appropriate media. That s it. 27Apr2011 Now Francoise kindly decide the condition of UVB irradiation. So I am doing the following experiments under the condition. I will observe DG probe and PKCdelta antibody accumulation. 1. Ctrl(negative) Just MDCK cells. 2. Ctrl(positive) PMA 3. UBV and leave 30 min 4. UBV and leave 1 hour 5. UBV and leave 3 hour 7. UBV and leave 30 min with D609 (D609 nothing after UVB) 8. UBV and leave 1 hour with D609 (D609 nothing after UVB) 9. UBV and leave 3 hour with D609 (D609 nothing after UVB) 10. UBV and leave 3 hour with D609 (D609 still incubation after UVB) 11. no D609 12. D609+100microM ATP 13. D609+100microM ATP+1microM U73122 22Apr2011 Thinking about the experiment I have to do. 1. I can get PKCgamma antibody within next week. So I gonna do the following experiment. A. EYFP-C1AB, PKCgamma antibody, DsRed. B. EYFP-C1AB, PKCgamma antibody, DsRed with SMase. C. EYFP-C1AB, PKCgamma antibody, DsRed with SMase and D609. 2. check whether DAG flop is inhbited in the presence of U73122. Actually when I did this expeirment previously using 100 microM U73122, unexpectedly more bright fluorescence comes up. Maybe some artifact. So I gonna reduce the concentration of U73122. A. 100 microM ATP B. 100 microM ATP, 10 microM U73122 C. 10 microM ATP D. 10 microM ATP, 10 microM U73122 3. I am gonna observe the effect of MbCD, FumonisinB1, ISP1, DMS and NB-DNJ in fixed cells. A. EYFP-C1AB and DsRed B. EYFP-C1AB and DsRed with 10mM MbCD + 12.5unit/ml BcPLC C. EYFP-C1AB and DsRed with 10microM(?)Fumonisin B1 + 12.5unit/ml BcPLC D. EYFP-C1AB and DsRed with 50nM ISP1 + 12.5unit/ml BcPLC E. EYFP-C1AB and DsRed with 6 microM DMS + 12.5unit/ml BcPLC F. EYFP-C1AB and DsRed with 100 microM NB-DNJ + 12.5unit/ml BcPLC 07Apr2011 Thinking about discussion with Francoise. 1. I am giving Francoise MDCK cells. 2. I gonna show the paper I am preparing now. 3. I gonna give her D609, rottelin Reiko has. 4. I gonna give her the paper relationship with D609 and apoptosis, with rottelin and apoptosis, and MDCK and apoptosis, SMase and apoptosis. 25/Mar/2011 Thinking about biological significance, I am gonna try this experiment as follows. 1. noSMase 2. noSMase+U73122 3. noSMase+D609 4. SMase 5. SMase+U73122 6. SMase+D609 7. SMase+BcPLC 8. SMase+BcPLC+U73122 Express EYFP-C1AB, DsRed and PLCepsilon-HA Express EYFP-C1AB, DsRed and PLCepsilon-HA(dominega) Express EYFP-C1AB, DsRed and PLCalpha-HA Express EYFP-C1AB, DsRed and PLCalpha-HA(dominega) 24/Mar/2011 And then, I found another contraversy. In IPS1 experiment, flip doesn t occure even though without SM. I need to do same experiment with SMase. 22/Mar/2011 I am gonna do the following experiments from the data I took on 15/Mar/2011. At first, 10 microM U73122 experiment doesn t work. So I am gonna do increase its concentration or decreases in ATP concentration. This experiment is very critical to say that the EYFP-C1AB fluorescence is caused by DAG drived from PI-PLC. 1. 100 microM ATP 2. 100 microM ATP, 100 microM U73122 3. 100 microM ATP, 100 microM U73343 4. 10 microM ATP 5. 10 microM ATP, 100 microM U73122 6. 10 microM ATP, 100 microM U73343 Another point I have to mention is that 24 hour incubation with U73122 did not give the difference in outer DAG signal compared to ctrl. This means that PI-PLC doesn t contribute to outer DAG. But, I can see PI-PLC dependent outer DAG sigal. So I want to make clear the signal from PI-PLC caused by ATP addition is transient or sustained. I guess this signal is transient. I am gonna do 10min, 30min, 1 hour, 2 hour. In some case I am gonna remove the ATP in the middle of reaction. 15/Mar/2011 I am gonna take reproduciblity. 1. MDCK Cameleon with ATP no D609 2. MDCK Cameleon with ATP with D609 3. MDCK control no D609 4. MDCK D609 only 5. MDCK D609 ATP 6. MDCK D609 ATP U73122 7. MDCK D609 ATP U73343 8. MDCK D609 ATP R59949 9. MDCK D609 ATP SMase 10. MDCK D609 PMA 11. MDCK D609 DiC8 12. MDCK C1AB inner no D609 13. MDCK C1AB inner no D609 ATP 14. MDCK C1AB inner D609 15. MDCK C1AB inner D609 ATP 16. MDCK mGluR no D609 17. MDCK mGluR D609 18. MDCK mGluR D609 Result Patially success. I got good result about that in the presence of D609 and ATP the DAG signal was detected, but no signal in the presence of D609 only. Of course, no D609 gives very bright fluorescence. But disappointed point is that U73112 did not inhibit the fluorescence which is caused by addition of ATP. Interpretation of it is due to week effect of U73122. I need to increase in concentration of U73122 or decrease of concentration of ATP. And then, the points I need to condider is that in the presence of U73122, which is 24 hours incubation, DAG signal did not decreases. But transient increase caused by inner DAG caused by ATP through PI-PLC is detected. How do I come to term with these. 09/Mar/2011 The idea to observe DAG flop. 1. no D609 2. ctrl 3. ATP 10 min 4. ATP U73122 10 min 5. ATP R59949 10 min 6. ATP SMase 10 min 7. PMA 10 min 8. DiC8 10 min 9. Inner C1AB ATP 10.Inner C1AB ATP 1. About 9 and 10, C1AB is transfected one day before. 2. 2-10 is incubated with D609 for 6 hours. 3. 1067microl(97times11)HBSS is prepared 4. 33microl C1AB is put, means total 1100microl 5. 100microl pick up. Number1 6. 4microl D609 is put, total 1004 microl 7. Divide in half 8. first half, 5 microl ATP is added. 9. 100 microl pick up. Number2. 10. From remaining 400microl, each 100 microl is taken, add 1 microl PMA(10microM) and 1 microl DiC8 (100microM).Number 7 and Number 8. 11. About second half, 4microl ATP is added. 12. 100microl is picked up, Number3. 13. 1 microl U723122(15microM), R59949(10microM) or 2microl SMase(1unit) is added to each 100 microl, Number 4,Number5 and Number 6. Result In some part it is works well. But I missed to enter D609 in the cell which was supposed to be in the presence of U73122. So I need to do again about U73122. And My concern is C1AB probe expressed into the cells localized to the membrane in the presence of only D609. I need to chech this is really real or not. And I would be better to confirm that P2Y2R stay on the surface on the plasma membrane, by doing measure increase in calcium concentration. c 04/Mar/2011 I prepared WR19L cells, lymphocyte. I am gonna do the following experiments. I am gonna add 10 microM PMA, 100 microM DiC8, 12.5 units/ml Bc-PLC, 10 microM C6-Cer mixed with EYFP-C1AB probe. Experimental procedure WR19Lcells were spind down and collected. Cells were in total 815 microl(163microl*5 in each)HBSS solution. Add 25microl 3.8mg/ml EYFP-C1AB. 2microl 1mM PMA, 1mM alphaPMA, 100mM DiC8, 8.5microl of 12.5unit/ml Bc-PLC are put in the 1.5 ml tubes in advace. 168microl solution containing EYFP-C1AB is added in each tube and incubate 10 min. 30micro 20% PFA is added and fix for 10 min. After that, spine down cells and remove supernatant. Add 50mM NH4Cl for 5min. Spine down and suck up supernatant. Add 100microl HBSS. Result I could do it! I can see brighter fluorescence in PMA than that in control.About DiC8, It seems that there is no difference compared to control.About Bc-PLC, I could see very bright fluorescence in the cells which is aggregated, indicating that DAG is important for membrane fusion. 04/Mar/2011 I prepared WR19L cells, lymphocyte. I am gonna do the following experiments. I am gonna add 10 microM PMA, 100 microM DiC8, 12.5 units/ml Bc-PLC, 10 microM C6-Cer mixed with EYFP-C1AB probe. Experimental procedure WR19Lcells were spind down and collected. Cells were in total 815 microl(163microl*5 in each)HBSS solution. Add 25microl 3.8mg/ml EYFP-C1AB. 2microl 1mM PMA, 1mM alphaPMA, 100mM DiC8, 8.5microl of 12.5unit/ml Bc-PLC are put in the 1.5 ml tubes in advace. 168microl solution containing EYFP-C1AB is added in each tube and incubate 10 min. 30micro 20% PFA is added and fix for 10 min. After that, spine down cells and remove supernatant. Add 50mM NH4Cl for 5min. Spine down and suck up supernatant. Add 100microl HBSS. 18/Feb/2011 I am gonna follow Malhotra s procedure. I prepared the liposomes as follows. 1. POPC only=60 2. POPC/PS=60/20 3. POPC/GM1=60/20 These liposome includes 2mol% Rhodamine-PE 1. POPC(0.2micromol) avanti 13.7mM 14.6microl 2. PS(0.04microl)avanti 100721 2.3mM 0.45 microl 3. GM1(0.04micromol) sigma G7641 1mM 1.128 microl 4. Phodamin-PE(4nmol) Avanti 0.15 mM 28 microl 1. I diluted these liposomes in 666microl, 888microl, 888microl in each. This means that 300 microM liposomes. 2. I am gonna pick up 100 microl in each. 3. EYFPC1AB domain is 1 mg/ml I am gonna add 1microl into 100 microl. This means that 10 microg/ml. 4. About DiC8, I have 1M DiC8 now (DMSO). I am gonna dilute this solution 200 times(PBS(-)), this means 5mM. Add 1microl into 100 microl. I want to prepare as follow. A. POPC B. POPC+probe C. POPC+probe+DiC8 D. POPC/PS E. POPC/PS+probe F. POPC/PS+probe+DiC8 G. POPC/GM1 H. POPC/GM1+probe I. POPC/GM1+probe+DiC8 5. FRET mesurement.30 min incubation. excitation 488 nm emission 500-650nm 6. Flotation assay (I can only use 4 samples for ultracentrifugation) B. POPC+probe C. POPC+probe+DiC8 H. POPC/GM1+probe I. POPC/GM1+probe+DiC8 7. Normalize with fluorescence of liposomes. 8. Apply sample solution to SDS-Page. 9. Stain with GFP antiboly. 06/Feb/2011 I couldn t make liposomes previously in 03/Feb/2011. However, I leave these lipid films for 1 week in the room condition. This might cause some bad effect on these membranes. So, I gonna make liposome again with same condition with littele modification. Because previous study use fluorescence PE was used 2mol%. I am gonna increase the volume of Rhodamine-PE from 0.5 to 2 mol%. So, 1. POPC only 2. POPC/DAG=60/6 3. POPC/DAG/GM1=60/6/20 4. POPC/DAG/PS=60/6/20 5. POPC/PS=60/20 6. POPC/GM1=60/20 Phodamine-PE is inluded all 2 mol%. 1. POPC(0.2micromol) avanti 13.7mM 14.6microl 2. PODG(0.033micromol) avanti 800815C 3.4 mM 9.8 microl 3. PS(0.04microl)avanti 100721 2.3mM 0.45 microl 4. GM1(0.04micromol) sigma G7641 1mM 1.128 microl 5. Phodamin-PE(4nmol) Avanti 0.15 mM 28 microl So then, I am gonna prepare following. 1. Take 102 microl POPC and 196 microl PE. 2. Mix and take 42.6 microl each in 6 tubes. 3. 9.8microl DAG is added 2,3,4 tubes. 4. 1.1microl GM1 is added 3,6 tubes. 5. 0.5microl PS is added 4,5 tubes. result I try sonication extensivly. But didn t make liposomes containing DAG even though biophysical journal paper shows that they could make liposomes. 03/Feb/2011 Lipid filmes prepared in 20/Jan/2011 was voltexed. But 5,6 didn t make liposomes. 2,3,4 did but rim of glass tube have fluorescence lipids, I am afraid of phase separation of DAG on the glass tube. Only 1 made liposomes well. 20/Jan/2011 I did the experiment of 09/Jan/2011 But this experiment didn t work well. Even positive control didn t work well, which is same result of ctrl. Toshi-sensei said that the distance between fluorescent PE and EYFP-C1AB doesn t become close enough. So I am gonna give up this experiment. I am gonna do following expeiment. I will prepare following liposomes. 1. POPC only 2. POPC/DAG=60/6 3. POPC/DAG/GM1=60/6/20 4. POPC/DAG/PS=60/6/20 5. POPC/PS=60/20 6. POPC/GM1=60/20 Phodamine-PE is inluded all 0.5 mol%. 1. POPC(0.2micromol) avanti 13.7mM 14.6microl 2. PODG(0.033micromol) avanti 800815C 3.4 mM 9.8 microl 3. PS(0.04microl)avanti 100721 2.3mM 0.45 microl 4. GM1(0.04micromol) sigma G7641 1mM 1.128 microl 5. Phodamin-PE(1nmol) Avanti 0.15 mM 7 microl So then, I am gonna prepare following. 1. Take 102 microl POPC and 49 microl PE. 2. Mix and take 21.6 microl each in 6 tubes. 3. 9.8microl DAG is added 2,3,4 tubes. 4. 1.1microl GM1 is added 3,6 tubes. 5. 0.5microl PS is added 4,5 tubes. 09/Jan/2011 I read a paper in which they made liposomes. I will modify a little bit. And I am gonna detect FRET signal. ex 488 nm, em 560 nm. 1.POPC/BODIPYPE(530/560)=60/0.6 2.POPC only (as ctrl) 3.POPC/PS/BODIPYPE(530/560)=60/6/0.6 (positive ctrl) 4.POPC/GM1/BODIPYPE(530/560)=60/6/0.6 5.POPC/GM1=60/6 (as ctrl) Each is divided into two samples. One is for ctrl. The other is for Bc-PLC addition. 1. POPC(0.2micromol) avanti 13.7mM 14.6microl 2. BODIPYPE(530/560)(0.004micromol) Molecular probe 1 mM 2microl 3. PS(0.02microl)avanti 100721 2.3mM 0.245 microl 4. GM1(0.02micromol) sigma G7641 1mM 0.564 microl 03/Jan/2011 I did the condition of 02/Dec. But this lipid mixture did not make liposomes more than previous condition. So Next thinking is that remove cholesterol. That menas that POPC/SM/DAG=60 20 10 and so on. And I did the experiment in which I see the effect of C1AB on cell growth. MDCK and HEK cells. I cultured HEK cells as following condition. cell concentration is 1.62*106 cells/ml. 10microl solution was added to 500microl medium. After that 10microl 3.8mg/ml C1AB was added. Ctrl is only 10microl 200mM imidazole buffer solution. About HEK cells, 3.0*105 cells/ml was prepared. 30microl this solution was added to 500microl DMEM solution. After that, 25microl 3.8mg/ml C1AB solution was added. 1. POPC(0.2micromol) avanti 13.7mM 14.6microl 2. brainSM(0.066micromol) avanti 860062C 31.4mM 2.1 microl 3. chol(0.2micromol) unknown 10.2mM 19.6microl 4. PODG(0.033, 0.066micromol) avanti 800815C 3.4 mM 9.8, 19.6 microl So, I made such liposomes. 1. POPC=60 2. POPC/DAG=60/5 3. POPC/DAG=60/10 4. POPC/SM=60/20 5. POPC/SM/DAG=60/20/10 6. POPC/SM/DAG=60/20/20 02/Dec/2010 It turns out that these lipid mixture I prepared in 30/Dec did not form liposomes. So, I asked Toshi-sensei how to make liposomes well. うえだくん、 コレステロールを増やせばうまくいくかも知れません。 POPC/SM/chol/DAG=60 20 60 10とか。 試してみてもらえますか？ 小林 So I made liposome as follows. 1. POPC(0.2micromol) avanti 13.7mM 14.6microl 2. brainSM(0.066micromol) avanti 860062C 31.4mM 2.1 microl 3. chol(0.2micromol) unknown 10.2mM 19.6microl 4. PODG(0.033, 0.066micromol) avanti 800815C 3.4 mM 9.8, 19.6 microl So, I made such liposomes. 1. POPC/SM/chol=60/20/60 2. POPC/SM/chol/DAG=60/20/60/10 3. POPC/SM/chol/DAG=60/20/60/20 30/Dec/2010 I prepared liposomes newly. SM was included because SM is important for distribution of DAG on the membrane. And then, I mimicked the outer leaflet of the plasma membrane. So, I used as follows 1. POPC(0.6micromol) avanti 13.7mM 43.8microl 2. brainSM(0.2micromol) avanti 860062C 31.4mM 6.3 microl 3. chol(0.2micromol) unknown 10.2mM 19.6microl 4. PODG(0.1, 0.2, 0.3,0.4 micromol) avanti 800815C 3.4 mM 29.4, 58.8,88.2,117microl So, I made such liposomes. 1. POPC/SM/chol=60/20/20 2. POPC/SM/chol/DAG=60/20/20/10 3. POPC/SM/chol/DAG=60/20/20/20 4. POPC/SM/chol/DAG=60/20/20/30 5. POPC/SM/chol/DAG=60/20/20/40 28/Dec/2010 EYFP-C1AB 1.77 mg/ml now (M.W=38,000) I took 3 microl this means 1.77 mg*3microl/1000microl=5.31 microg. So 5.31/38000=0.0001397micromol=0.1397nmol. 1 cell have 1 fmol DAG. glass base dish maybe has 10000 cells/1 well. So 1 fmol*10000=10pmol DAG. but outer DAG is less assume 1%. So 100fmol DAG. liposome 19mM DOPC 52.6microl this means 19 mmol/1000000microl*52.6microl=1micromol. 3.2mM DODG 12.5microl this means 3.2mmol/1000000microl*12.5microl=40nmol. These two are mixed, so 4%mol DAG. suspended in 200microl HBSS. 100microl picked up, means 500nmol PC 20 nmol DAG. vesicle contains two side, so 250nmol PC 10nmol DAG I did liposome experiment, but result is mysterious. In the presence of DAG in PC liposome, fluorescence light is brighter than that in the presence of only PC liposome. I think about this. Basically, I don t know what happen, but there is some hint. 1. cells were ripped off when both liposome was added, this means that PC works as detergent because I add a lot of liposome, 500 nmPC. So I need to reduce the amount of PC liposome. 2. In this experiment, I add 4mol% DAG in PC liposome. But other experiment, for example SM-lysenin, give 20mol% DM into PC liposome. So I can add more DAG, maybe at least 10%, possbly 20%-40%. As you know, If DAG included more, this membrane doesn t make a liposome. So I need to take care about it. Next time, I am goning to prepare the liposome, リポソームですが、1mMを1ml位用意して、 蛋白の濃度にもよると思いますが、 こちらの実験では、ＧＦＰ－Ｌｙｓの場合、 いつも、５０倍希釈で染色しているので、 (１マイクロ/５０マイクロＰＢＳ） １マイクロに、５０マイクロのリポソームを混ぜて、 ３７度で３０分してから、それで染色していました。 １ｍＭはかなり濃い濃度なので、タンパク質はすべて 結合すると考えています。 さっき探していた論文ですが、(準備中） For the preabsorption experiment, Dronpa-θ-D4 or Dronpa-NT-Lys was incubated with MLVs at 37°C for 30 min prior to apply them to HeLa cells. としか書いてありませんでした。 これで良いですか？ 牧野 Reply Forward Reply |Ueda Yoshibumi to Asami show details Dec 17 (7 days ago) リポソームを作るとき、はじめに、クロロホルムに溶けた脂質を遠沈管の中に加えて、 窒素で飛ばしてからPBSなどを加えてベシクルにするんだよね？ だいたい、クロロホルムに溶けた1mM脂質（例えばDOPC)を何μl位遠沈管に入れて乾かしていますか？ それは脂質のストック濃度によると思います。 １０ｍＭの脂質ストックなら１００ulだし、２０ｍＭなら５０です。 それで乾いてから1mlのＰＢＳをいれて、 最終濃度1mMリポソームが 1mlできるということです。 Show quoted text - Reply Forward Reply |Ueda Yoshibumi to Asami show details Dec 17 (7 days ago) １ｍMだったら脂質を１ｍｌ入れているっていうことだね。 かなり多い量を加えているんだね！ なるほど、わかりました。 Reply |Asami Makino to Ueda show details Dec 17 (7 days ago) でも、結局リポソームは５０マイクロＬとか使わないから、 1mlも作る必要ないと思う。 ２００マイクロでも作れば充分なんじゃないかな。 ただ、こちらにある脂質のストックはほとんど10mM以上あるので たくさんある脂質は少量はかり取るのが大変だから、 たくさん使ってもいいと思います。 Original Message ----- From Ueda Yoshibumi To Asami Makino Show quoted text - Sent Friday, December 17, 2010 3 31 PM Subject Re MLV なるほど、了解しました！ So, I prepared vesicles. I use 10microg/ml YFP-C1AB to stain the cells. YFP-C1AB M.W. 38kDa=38,000 This means 0.000263micromol/ml I add 100microl, So total amount is 0.02nmol. I want to include DAG into the vescle And then, 1 cells has 1 fmol DAG. glass based dishes is maybe 10 pmol DAG.
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HPアドレス http //210.131.65.168 特徴 試験運転 コメント BOTプレイヤー[マイ、Hades]がいた！ -- ななし (2007-02-27 16 52 16) BOTプレイヤー[Leon、煉]がいた！ 金増殖技も使用ｗ -- ななし (2007-02-27 19 12 51) 俺の場合は金増殖技だけだなｗ -- Leon (2007-02-27 20 29 12) 自演してんなよ社会のカスが -- ななし (2007-02-27 20 31 36) BOTプレイヤー[マイ、Hades]がいた！ -- ななし (2007-02-27 16 52 16)と俺の場合は金増殖技だけだなｗ -- Leon (2007-02-27 20 29 12)は俺の書き込みだが自演はした覚えはねぇよｗ 自演と決めつけんじゃねぇよksg！ｗ -- Leon (2007-02-27 20 34 53) 反応がすでにイタイ -- 名無しさん (2007-02-27 21 21 34) まぁこの書き込みに一々返信してるのがBOTプレイしてる奴ってのは確定なわけだ -- Leon (2007-02-27 21 33 50) 見事に釣られてるわけだ 乙＾ｗ＾ -- Leon (2007-02-27 21 34 08) ・・・そろそろ自演終わりにしたら？ｗ -- 名無しさん (2007-02-27 22 23 56) Leonは有名なリア厨ですが -- Leon (2007-02-27 22 38 57) 俺いつのまに[有名なリア厨]になったんだろ？ｗ この名前で書き込みしだしたのこの前からだぜ？ｗ -- Leon (2007-02-27 22 42 44) 削除されてやんのｗｗｗｗｗｗｗｗﾃﾗﾊﾞﾛｽｗｗｗｗｗｗｗｗｗ -- 名無しさん (2007-02-27 23 42 04) マイ、Hades消えてるしｗﾜﾛｽｗ -- Leon (2007-02-28 21 53 26) 健在ﾃﾞｽｶﾞ( ´,_ゝ｀)ﾅﾆｶ? -- 名無しさん (2007-02-28 22 36 33) すみません、私がウンコでした。吊ってきます。 -- Leon (2007-02-28 22 39 55) 俺の発言から すみません、私がウンコでした。吊ってきます。 -- Leon (2007-02-28 22 39 55) なんてしねぇよｗ 人の発言をよく見てそいつがしゃべりそうな風にしねぇと偽者ばればれだアホｗ -- L.eon (2007-02-28 22 47 39) 書き込み時間からして(2007-02-28 22 36 33) と(2007-02-28 22 39 55) は同一人物っと......〆（ｗ＾ -- L.eon (2007-02-28 22 49 47) Leonﾊﾞﾛｽｗｗｗｗｗ -- 名無しさん (2007-02-28 22 50 21) 笑ってろ笑ってろｗ エミュごときでBOT使うクソプレイヤーが＾ｗ＾ -- Leon (2007-02-28 22 54 02) マイ、Hades消えてるしｗﾜﾛｽｗ -- Leon (2007-02-28 23 04 26) なんで同じ書き込みがあるんだ？ｗ -- Hades (2007-02-28 23 16 09) LeonまじショボスギｗｗｗｗGMにもスルーされてるしｗｗｗｗ -- 名無しさん (2007-02-28 23 17 55) ななしで書き込む意味ないんじゃね？ｗ スルーかどうかわかるのは俺が通報してるHades or マイ のみだろうｗ -- Leon (2007-02-28 23 26 07) Leon最高ｗｗｗｗ -- 名無しさん (2007-02-28 23 50 14) そうそう、それと俺は煉と一緒に狩りはしてないぞ^-^ -- Leon (2007-02-28 23 56 13) ましてやお前と違ってエミュでBOTするようなアホじゃない^-^ -- Leon (2007-02-28 23 56 57) 俺はBOTなんか使ってないよ -- Leon (2007-03-01 00 09 34) 第一やり方もわからんし、知りたくもない^-^ -- Leon (2007-03-01 00 10 19) 人の名前使うんじゃねぇよ(-` どうせ、お前は俺がこう書いたら[自作自演やめたら？ｗ]とでも言うんだろうｗ -- Leon (2007-03-01 00 16 18) Leonがひとりでデマをわめきちらした挙句に鯖管に訴えるも見事にスルーされてションボリ。で、今ここで自演中 -- 名無しさん (2007-03-01 04 00 10) 自演うざいﾏｼﾞﾃﾞ消えろ -- 名無しさん (2007-03-01 05 09 22) 自演に見えるお前らの目がおかしい＾ｗ＾； -- Leon (2007-03-01 06 31 41) あと俺はデマなんていっちゃいねぇよｗ マイとHades がBOTってのは本当だ 狩りしてて返事も何もなく殺したら起き上がって自動で狩りをしだす これを繰り返して30回はPKしてんだぜ？ｗ デマじゃねぇよ（`ー） -- Leon (2007-03-01 06 33 25) ついでだとLeonがひとりでデマをわめきちらした挙句に鯖管に訴えるも見事にスルーされてションボリ。で、今ここで自演中 -- 名無しさん (2007-03-01 04 00 10) の書き込みは80%以上、Hades、マイの書き込みだ -- Leon (2007-03-01 06 34 02) 80%以上とかｗｗｗ真性ｱﾎスｗｗｗ -- 名無しさん (2007-03-01 06 41 45) 理由1 まずデマと言い切れるほうがおかしい 理由2 デマと言い切れるにあったってその場にいた当事者[マイ、Hades、俺、煉]以外はその場にいなかったのでデマと言い切れる奴はいない 以上からしてデマと言い切ってるお前はHades or マイ って言ったわけだ -- Leon (2007-03-01 06 43 42) のこりの20%の理由は？ｗ -- 名無しさん (2007-03-01 06 55 50) 理由1 俺は癇癪餅 -- Leon (2007-03-01 06 56 54) 理由2 俺は妄想癖 -- Leon (2007-03-01 06 57 36) 理由3 Botでウマーしてる奴に嫉妬 クリック大好き -- 名無しさん (2007-03-01 06 58 52) だから人の名前勝手に使うんじゃねぇよｗｗｗｗ -- Leon (2007-03-01 15 08 44) へ～、こんな鯖あったのか～。ここで遊んでる人は今トレンドのNとやらはあえてやってないの？ -- 名無しさん (2007-03-01 20 27 57) N鯖の宣伝すんな。来られても困る -- 名無しさん (2007-03-01 20 31 55) 宣伝じゃねえよ。俺N住人じゃねえし -- 名無しさん (2007-03-01 22 58 55) 何この自演鯖 -- 名無しさん (2007-03-03 17 17 38) へ～、こんな鯖あったのか～。ここで遊んでる人は今トレンドのNとやらはあえてやってないの？ -- 名無しさん (2007-03-01 20 27 57) トレンドって超懐かしい響きｗｗｗ お前も年配組みだなｗ 仕事しろｗｗｗ -- 名無しさん (2007-03-06 09 35 33) 人が少ない・イベントなし・ドロップ率悪くコレといった特色のない鯖。 -- 名無しさん (2007-03-09 23 05 55) 建ててみた、公開してみた。ただそれだけの鯖だな -- 名無しさん (2007-03-10 13 59 20) プレイヤーがめちゃ少ない・・・・・寂しいかも -- 名無しさん (2007-03-10 18 58 07) ちょｗｗｗｗｗｗｗ閉鎖？マジ？マジ？ -- なにこれ (2007-03-10 23 38 18) おまｗｗｗｗｗｗｗサイト消えとるｗｗｗｗｗｗｗｗｗ -- 名無しさん (2007-03-11 00 41 36) http //jbbs.livedoor.jp/game/36441/ -- ＼(^o^)／ｵﾜﾀ (2007-03-11 05 03 44) いぁ、確かメンテするって書いてあったような・・・丸一日くらい -- 名無しさん (2007-03-11 10 14 51) メンテ3月10日22 00～12日5 00だったっけ？ -- 名無しさん (2007-03-11 10 31 24) １１日の５時って、まさか１７時？ -- 名無しさん (2007-03-11 14 31 36) 2007年03月10日 3/10 22 00～3/11 5 00 メンテナンス -- 名無しさん (2007-03-11 18 09 37) ＢＢＳ自体が閉鎖されてるのがなぁ・・・ -- 名無しさん (2007-03-11 18 10 28) HPとか繋がらないから状況がまったくわからない・・・一応ログイン鯖はまだ繋がるね -- 名無しさん (2007-03-11 18 42 21) ログイン鯖にすら繋がらんです -- 名無しさん (2007-03-11 19 06 08) IP please -- 名無しさん (2007-03-11 20 55 38) せめて、明日の５時まで待って何も無ければ…… -- 名無しさん (2007-03-11 22 12 16) それにしても〆るなら一言ぐらいあってもよさそうなんだけどなぁ。 -- 名無しさん (2007-03-11 22 12 46) ほんとに閉鎖っぽいな。 -- 名無しさん (2007-03-12 04 57 37) たぶんキャラデータが飛んだのでしょうね… メンテ直前のカウントダウンが１分前からでしたので一抹の不安はありました＞＜ 鯖管さんの性格を推測するとこの状態が許せなかったから、突然の閉鎖につながったのでしょうね -- 名無しさん (2007-03-12 05 23 20) いや、メンテ前１０秒告知のときもあったし。多分それは無さそうな気がする。あのとき戦闘中でどないせーっちゅうんじゃｗｗｗって状態でもなんとも無かったし -- 名無しさん (2007-03-12 05 41 50) Lから始まる名前のPCがウザすぎて嫌になったって噂があったな・・・ -- 名無しさん (2007-03-12 07 32 34) 管理人さんここに一言ぐらい書き込んでくれないかな・・・ -- 名無しさん (2007-03-12 22 48 02) そうだよな。メンテするって告知してコレだからな～最初から閉鎖するって告知してれば問題なかったのに・・・ -- 名無しさん (2007-03-13 00 02 27) 何か事情があったのかも。 -- 名無しさん (2007-03-13 09 19 37) 122.196.10.176 -- 名無しさん (2007-03-14 12 55 37) ↑ＰＶ好きさんcome -- 名無しさん (2007-03-14 12 56 02) ↑ben2鯖のIPですね… オートでないのにIPだけ教えても～orz -- 名無しさん (2007-03-14 16 31 37) 宣伝ヤメロ -- 名無しさん (2007-03-14 21 15 41) いつ鯖復活なんだろ・・・・もぅ糸冬 了？ -- 名無しさん (2007-03-19 15 44 35) 猛暫くは様子見 -- 名無しさん (2007-03-24 16 41 54) 4月一杯様子見て動き無ければ削除でよろしくです -- 名無しさん (2007-03-28 22 16 32) 名前 コメント
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1999/09/09 発売収録数：30曲 ジャンル タイトル アーティスト 備考 AC初出/CS移植 beatmania APPEND 4thMIX～the beat goes on～ HARD HOUSE 20,november(hard mix) dj nagureo BONUS TRACK completeMIX HOUSE 20,november (nagureo kidding style) DJ nagureo BONUS TRACKANOTHER ONLY1P：single mix2P：radio edit 3rdMIX HARD TEKNO Acid Bomb DJ FX BONUS TRACKANOTHER ONLY completeMIX HARD TECHNO Attack the music (crack style) DJ FX BONUS TRACKANOTHER ONLY 3rdMIX DANCE POP Believe again(english version) e.o.s remixed by dj nagureo featuring miryam BONUS TRACK completeMIX HOUSE BRAND NEW WORLD GTS featuring MELODIE SEXTON 提供曲 4thMIX TECHNO BUILD-UP FORWARD 提供曲 4thMIX RAVE CHAIN RAM 4thMIX DANCE POP deep in you dj nagureo 隠し曲 4thMIX BIG BEAT DESTRUCTION MPM 4thMIX MINIMAL DRUNK MONKY DJ ODDBALL 4thMIX TRANCE GENOM SCREAMS L.E.D.LIGHT GOTTAMIX R B HUNTING FOR YOU TOGO PROJECT feat. MEGU SCOTTY D GOTTAMIX R B I LIVE JUST 4U MPM 4thMIX JAZZY HIPHOP JAZZ A PUMP UP TAKUMI 4thMIX CUBE BEAT KAKATTEKONKAI BEBE 提供曲 4thMIX DANCE POP KEEP ON MOVIN N.M.R. 4thMIX HAPPY LOGICAL DASH DJ TAKA 4thMIX EURO BEAT Luv to me(english version) third-mix BONUS TRACK completeMIX JUNGLE PARANOIA MAX～DIRTY MIX～ 190 4thMIX DEEP HOUSE peace-out dj nagureo 隠し曲 4thMIX HIPHOP POPCORN DJ WATARAI 4thMIX J-TEKNO quick master(reform version) Yohei Shimizu BONUS TRACK completeMIX FUTURE JAZZ RUGGED ASH SYMPHONIC DEFOGGERS 4thMIX DRUM N BASS SODA SLAKE GOTTAMIX LOUNGE SPACED OUT ENOLA QUINTET 隠し曲 4thMIX SOUL HIPHOP TAKE A RIDE LARRY DUNN 4thMIX 70 S SOUL TAKE CONTROL LARRY DUNN 4thMIX HARD HOUSE WEIGHTED ACTION DEEP EMOTION 4thMIX JAZZ HOUSE YOU MAKE ME MONDAY MICHIRU 提供曲 4thMIX
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GENRE TITLE ARTIST bpm notes CLEAR RATE FUTURE JERSEY take me higher KOTONOHOUSE 140 647 n%（yyyy/mm/dd） 攻略・コメント ノート数の割に16分乱打が多く、やや強め -- 名無しさん (2020-06-16 20 32 59) 典型的な自力譜面だが長い16分乱打と終盤の二連皿が脅威。BPMが140だから☆7に収まったみたいな譜面。 -- 名無しさん (2020-07-25 14 51 50) 名前 コメント
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映画 中二病でも恋がしたい! -Take On Me- Blu-ray 三方背スリーブケース付き 発売日：７月１８日 【初回特典】 ・キャラクターデザイン池田和美描き下ろし特製ケース ・スペシャルブックレット ・メモリアルフォト3枚セット ここを編集 2018年1月公開。中二病でも恋がしたい！の劇場第2作。前作のAmazonインスタントビデオが配信開始。 http //www.anime-chu-2.com/movie/ 監督 石原立也 原作 虎虎 脚本 花田十輝 絵コンテ 石原立也 演出 石原立也、北之原孝將、武本康弘 CG演出 植田弘貴 キャラクター原案 逢坂望美 キャラクターデザイン・総作画監督 池田和美 作画監督 明見裕子、丸子達就、植野千世子、角田有希、池田晶子、岡村公平、西屋太志、池田和美、門脇未来 設定 高橋博行 動画検査 黒田比呂子 美術監督 篠原睦雄 3D美術 鵜ノ口穣二 色彩設計 竹田明代 撮影監督 浦彰宏 3D監督 山本倫 特殊効果 三浦理奈 編集 重村建吾 音響監督 鶴岡陽太 音響効果 森川永子 録音 名倉靖 音響効果助手 林佑樹 録音助手 亀本美佳 音楽 虹音 文芸 西川昌志 アニメーション制作 京都アニメーション 制作協力 アニメーションDo ☆ショートムービー 絵コンテ・演出 石原立也 作画監督 岡村公平 Amazonインスタントビデオ：小鳥遊六花・改 ～劇場版 中二病でも恋がしたい！～ 監督 石原立也 出演：内田真礼,福山潤 再生時間：1 時間, 36 分 初公開日/初回放送日 2013年9月 提供 TBSオンデマンド ■関連タイトル Blu-ray 映画 中二病でも恋がしたい! -Take On Me- スペシャルイベントチケット優先販売申込券付き 『映画 中二病でも恋がしたい!-Take On Me-』オリジナルサウンドトラック 主題歌集 ~中二病奥義・三曲の極み~ Single, Maxi ドラマCD 極東魔術昼寝結社の夏に聞く黙示録 中二病でも恋がしたい ボーカルミニアルバム フィギュア・ホビー：中二病でも恋がしたい！ 原作小説 虎虎・逢坂望美／中二病でも恋がしたい! rakuten_design= slide ;rakuten_affiliateId= 053df7e0.7c451bd1.0c852203.190c5695 ;rakuten_items= ctsmatch ;rakuten_genreId=0;rakuten_size= 468x160 ;rakuten_target= _blank ;rakuten_theme= gray ;rakuten_border= on ;rakuten_auto_mode= on ;rakuten_genre_title= off ;rakuten_recommend= on ; 随時更新！ pixivFANBOX アニメ@wiki ご支援お待ちしています！ ムック本＆画集新刊／個人画集新刊／新作Blu-ray単巻／新作Blu-ray DVD-BOX アニメ原画集全リスト スタッフインタビューwebリンク集 最新登録アイテム Switch ゼルダの伝説 Tears of the Kingdom Switch 世界樹の迷宮Ⅰ･Ⅱ･Ⅲ HD REMASTER Switch ピクミン 4 大友克洋 Animation AKIRA Layouts Key Frames 2 小説 機動戦士ガンダム 水星の魔女 1 ONE PIECE FILM REDデラックス・リミテッド・エディション 4K ULTRA HD Blu-ray Blu-ray 劇場版 ソードアート・オンライン -プログレッシブ- 冥き夕闇のスケルツォ 完全生産限定版 Blu-ray 映画『ゆるキャン△』 Blu-ray 【コレクターズ版】 Blu-ray ウマ娘 プリティーダービー 4th EVENT SPECIAL DREAMERS!! Blu-ray 天地無用！GXP パラダイス始動編 Blu-ray第1巻 特装版 天地無用！魎皇鬼 第伍期 Blu-ray SET 「GS美神」全話いっき見ブルーレイ Blu-ray ソードアート・オンライン -フルダイブ- メーカー特典：「イベントビジュアル使用A3クリアポスター」付 ラブライブ！虹ヶ咲学園スクールアイドル同好会 5th Live! 虹が咲く場所 Blu-ray Memorial BOX 宇宙戦艦ヤマト2202 愛の戦士たち Blu-ray BOX 特装限定版 地球へ… Blu-ray Disc BOX 完全生産限定版 神風怪盗ジャンヌ Complete Blu-ray BOX HUNTER×HUNTER ハンター試験編・ゾルディック家編Blu-ray BOX BLEACH Blu-ray Disc BOX 破面篇セレクション1＋過去篇 完全生産限定版 MAZINGER THE MOVIE 1973-1976 4Kリマスター版 アニメ・ゲームのロゴデザイン シン・仮面ライダー 音楽集 テレビマガジン特別編集 仮面ライダー 完全版 EPISODE No.1~No.98 MOVIE リスアニ！Vol.50.5 ぼっち・ざ・ろっく！号デラックスエディション ヤマノススメ Next Summit アニメガイド おもいでビヨリ アニメ「魔入りました！入間くん」オフィシャルファンブック 『超時空要塞マクロス』パッケージアート集 CLAMP PREMIUM COLLECTION X 1 トーマの心臓 プレミアムエディション パズル ドラゴンズ 10th Anniversary Art Works はんざわかおり こみっくがーるず画集 ~あばばーさりー!~ あすぱら画集 すいみゃ Art Works trim polka-トリムポルカ- つぐもも裏 超！限界突破イラスト＆激！すじ供養漫画集 開田裕治ウルトラマンシリーズ画集 井澤詩織1st写真集 mascotte 鬼頭明里写真集 my pace 内田真礼 1st photobook 「まあやドキ」 進藤あまね1st写真集 翠~Midori~ 声優 宮村優子 対談集 アスカライソジ 三石琴乃 ことのは 亀田祥倫アートワークス 100％ 庵野秀明責任編集 仮面ライダー 資料写真集 1971－1973 金子雄司アニメーション背景美術画集 タローマン・クロニクル ラブライブ!サンシャイン!! Find Our 沼津~Aqoursのいる風景~ 機動戦士ガンダム 逆襲のシャア 友の会［復刻版］ 梅津泰臣 KISS AND CRY 資料集 安彦良和 マイ・バック・ページズ 『機動戦士ガンダム ククルス・ドアンの島』編 氷川竜介 日本アニメの革新 歴史の転換点となった変化の構造分析 Blu-ray THE IDOLM@STER CINDERELLA GIRLS 10th Anniversary Celebration Animation ETERNITY MEMORIES Blu-ray おいら宇宙の探鉱夫 ブルーレイ版 Blu-ray 映画 バクテン!! 完全生産限定版 アイカツ！ 10th STORY ～未来へのSTARWAY～ Blu-ray BOX 初回生産限定版 はたらく細胞 Blu-ray Disc BOX 完全生産限定版 Blu-ray 長靴をはいた猫 3作品収録 Blu-ray わんぱく王子の大蛇退治 Blu-ray 魔道祖師 完結編 完全生産限定版 魔道祖師Q Blu-ray Disc BOX 完全生産限定盤 にじよん あにめーしょん Blu-ray BOX 【特装限定版】 Blu-ray 鋼の錬金術師 完結編 プレミアム・エディション Blu-ray付き やはりゲームでも俺の青春ラブコメはまちがっている。完 限定版【同梱物】オリジナルアニメ Blu-ray「だから、思春期は終わらずに、青春は続いていく。」
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［”Schall” we step？］ 【シャルウィーステップ】 ［Monkshood］ ハイライト発生箇所 収録作品 ロング版収録 関連リンク ポップンミュージック eclaleで登場した楽曲。 担当キャラクターはシャル（エクラル-1P）。 "Schall" we step? / red glasses BPM 178 新難易度 EASY NORMAL HYPER EXTRA 10 25 39 46 ハイライト EASY NORMAL HYPER EXTRA 4 4 4 4 red glassesとしては初のインスト曲となる、ピアノをふんだんに使った優雅な踊りを思わせるアッパーチューン。前作ラピストリアで登場したタクトに付き添う精霊・シャルの成長した姿（・・・ではなく、デザイナーによればラピストリアよりも前の姿）が今回登場したためか、曲名はshallとschallを掛け合わせたものとなっている。コード進行・フレーズなども、前作で手がけた零と弌の鍵の唄を意識したフレーズもあり、前作ラピストリアの曲のテーマといえるキャラクターソングを意識した部分が垣間見られる。 曲からイメージできるように、ピアノのフレーズを弾かせる配置が中心となる。ハイパーは、序盤がスライドが若干多めだが、中盤以降から手が移動する交互連打が頻発するようになる。両手で交互に押せるものばかりなので、乱打などに慣れていれば押しやすいか。零と弌の鍵の唄と同様に12分・16分パートが入り乱れるのでリズムの切り替えも意識すること。EXはハイパーから傾向が打って変わって階段のオンパレードに。乱打もあるものの、ラストは階段のラッシュとなっており、特に終わり2小節の32分スライドが圧巻。ただしこのスライドは規則性があるので、両手で2個ずつの乱打と見て処理すると切り抜けられる。 ハイライト発生箇所 番号 5Buttons / EASY NORMAL HYPER EXTRA 1 2 3 4 Shallとschallを掛け合わせている。 収録作品 AC版 ポップンミュージック eclaleからの全作品 CS版 ロング版収録 pop n music eclale original soundtrack pop n music うさぎと猫と少年の夢 Original Soundtrack 20th Anniversary Edition "Schall" we step? ～I d love to～という題で収録。 関連リンク 関連曲 ［君の音とAuftakt］ 楽曲一覧/ポップンミュージック eclale
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On the edges of a building-forest skyscrapers leaning as though to fall I hid from view holding back my excited breath Threading a secret alleyway Friends fleeing,within fingertip reach It was more than just a game; it was... Somthing decided by destiny Even if my trail of breadcrumbs Should be ground into the sidewalk asphalt The wind,which pushes me forward carries back to me The familiar sound of your footsteps as well as the sound of your voice
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基盤に関しては考えなければならない事情があります。それは、基板上のボタンの数と、必要なボタンの数の兼ね合いです。つまり、７つのボタンが必要なのに５鍵コンだと５つのボタンしか無いからどうしようかという話です。 ５鍵コンの基盤を使うと、鍵盤が５個しかないので６鍵と７鍵をどこからか持ってこなくてはなりません。つまり、６鍵と７鍵に当たるキーは、ICの細かいピンに導線をハンダ付けしなければならず、かなり難しいです。ですが、非現実的というほど無理なわけではありません。 もし自作コンで遊ぶソフトがBMSならば、６鍵と７鍵に当たるキーを設定できるので、スタートボタンとセレクトボタンだった所を６鍵と７鍵に当てる方法が取れます。但しこの方法だと、スタートボタンとセレクトボタンを使えないためプレー中にハイスピの調節やシャッターの開閉ができません。また、家庭用beatmaniaIIDXでは、キーコンフィグ（アナログコントローラーを使う設定にするとできる）でスタートボタンとセレクトボタンを鍵盤に設定することができないので、この方法は使えません。 その他の方法としては、専コンの基盤を使うというものがあります。この方法だと失敗はほぼ有り得ず、安定して動作しますが、専コン自体が高い上、もうコナミでは販売中止されているので手に入りません。この方法に関しては、extra 專コンの基盤を利用の記事を参照してください。 それぞれ一長一短です。どれかの方法を選んでください。私は家ではBMSをするので、初めは６鍵７鍵をICピンから持ってくるつもりが、いじっているうちに壊してしまって、最終的にスタートボタンとセレクトボタンの線とICピンを使ってなんとか７つのボタンを確保しました。 ここでは私がやった、スタートボタンとセレクトボタンの線を６鍵と７鍵にあてる方法のやり方を紹介します。 さてそれでは、step3で取り出した基盤をいじくります。 まずマイクロスイッチについて。 回路では、電気が通っている状態を「閉じている」、電気が切断されている状態を「開いている」といいます。ビートマニアをする上では、COM端子とNO端子にそれぞれ導線をつなぎ、普段は電気が通らず、スイッチが押下されると通電することで反応します。 COM端子は基盤のグランドを引っ張ってきてつなぎ、１～７鍵StartSelectすべてのCOM端子を繋ぎます。 NO端子はそれぞれ基盤の対応する部分に繋ぎます。（詳しくは後で） 基盤の大きいメイン部です 上の写真からわかるように基盤には緑色の部分と黄緑色の部分があり、黄緑色の部分は、少し削ると金属が見えることからわかるように、電気が通る部分です。対して緑色の部分は電気が通りません。 もともとの基盤の仕組みを説明します。５つの黒い丸い部分が鍵盤に当たるもので、しかしこの黒い部分はそれぞれ上下に分かれていて、これを導電性のもので繋いであげると通電して鍵盤が押された判定が生まれます。 この「黒い丸の下の部分」は、全ての「黒い部分の下の部分」で繋がっています（黄緑色の領域で繋がっている）。これは多分、回路のground（低電位側）に当たるもので、自作コンのマイクロスイッチに配線する際も、マイクロスイッチのCOM端子を全てつなげます。（詳しくは後述します） 工程１ 基盤を外箱に固定 基盤を木箱に固定します。場所と向きは次の画像のとおりです。（画像は完成品を撮ったので配線済みです。すみません） この基盤は裏が平らでないため外箱に直接くっつけると不安定になってしまいます。なので、木材の余りから30~40mm立方のブロックを作り、それを間に挟んで固定しました。 外箱とブロックは木工用ボンドで、ブロックと基盤は両面テープで固定します。 スタートセレクトの基盤も、両面テープで外箱に固定してしまいましょう。皿の基盤も付けてしまって大丈夫です。プラスドライバーで留めましょう。 工程２ 導線を切り、片方にファストン端子をかしめてマイクロスイッチに固定。 ここでは、スタートセレクトを使って７つの鍵盤とする方法で説明します。 早速導線を作るのですが、導線の長さをどれくらいにすればよいかというと、基盤とマイクロスイッチの間の長さから少し余裕をもたせたくらいにします。なのでまずは基盤とマイクロスイッチの配線する場所を確認します。 これに合わせて導線の長さを決めます。 それと、次の工程を見ておいて、単芯と複芯とどっちの導線を使うか考えておきましょう。 ここで、基盤の各端子とマイクロスイッチの各NO端子は普通に一本の導線で繋げば良いのですが、基盤のグランドと繋ぐCOM端子（上の図では茶色の導線）は全てのマイクロスイッチを渡すように繋ぎます。つまり、1鍵と3~6鍵のCOM端子は２本の導線を同時にかしめたファストン端子をさします。 導線を適当な長さに切ったら、必ず先に導線にファストン端子カバーを通してから、電工ペンチで導線の片側にファストン端子をかしめます。 電工ペンチの使い方 かしめる線が少なくて外れてしまいそうなときは、線を長めにとって２つ折にしたりして大きさを稼ぎます。 工程３ 導線のもう片側をハンダ付け もう片側は基盤にハンダ付けをします。基盤にハンダ付けするときは導線を複芯のものを使用します。 ここからは、ハンダ付けの説明になります。 ハンダ付けとは、金属と他の金属を電気的に接続するときに使う方法で、ハンダという比較的低い温度で溶ける金属をつかって、のりのように２つの金属をくっつけてしまおうというものです。 ハンダと金属は若干混ざることでくっつくらしく、そのためにはハンダごての熱で、ハンダだけでなくくっつけたい金属も熱する、というのがコツです。 具体的には、大体ですが、 くっつけたい２つの金属を触れさせて、そこにハンダごてを当てて２秒。 そこにハンダをくっつけて、ハンダを適量溶かして２秒。こてを引く。 という感じです。 結果的にこんな感じになります。 基盤にハンダ付けをするときは、基盤の表面をカッターなどで少し削って金属部を露出させ、そこにハンダ付けをします。 ７つ＋COM端子１つの８つをハンダ付けしたら完成です。パソコンにつなげてコントロールパネルからゲームコントローラの設定を開いて、すべて正常に反応するか確認しましょう。 番外編 ICピンにハンダ付けしたい なんらかの事情で（基盤を熱しすぎて反応しなくなった、スタートセレクトを使いたい）ICピンにハンダ付けしたいという方はこちらを参考にして下さい。 ASCIIの５鍵コンはICが２通りあるそうで、私が買った５鍵コンはICがダイヤ型のものでした。他にICが長方形のものがあるそうですが、そちらの詳しいことはわかりません。 ICピンの一つを狙ってハンダ付けしようとしても、ピンはかなり細かいため難しく、これは私はできませんでした。 話を少し変えて、NO端子をICピンのどこにはんだ付けすれば良いかを考えます。 まず、１〜５鍵で予約されているボタンは、４，７，３，８，２、スタートセレクトが９，１０、皿が上、下です。よって残っているのが、１，５，６の３つです。 次に、ICピンのどれがどのボタンに対応しているかを調べた図が下です。（基盤を結構いじってから調べたので、正常な状態でこうなのか保証できません） これを見てわかるように、たとえば左側の６の両脇は何も当てられていなかったりします。つまり、ハンダ付けをするときに隣を巻き込んでも大丈夫（な可能性がある）わけです。 ということで、おすすめは、上の端にある１と、右の端から２つ目にある６です。これに単芯の導線でハンダ付けをしましょう。 私が実際にやった所、ハンダを５mmほどニッパで切ってハンダ付けしたい所に先に置いておいて、導線とハンダこてを近づけてくっつける、というやり方が良いように思われました。位置の微調節は爪楊枝を使ってやるとうまくいきました。 この写真では１と２にハンダ付けした所です。これで今の所うまく動いていて、たまに（年に３回くらい）不調が出ますがハンダ付けしてやれば直ります。 step5 皿周り・ボタン調節へ
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戦いの前の静けさの中で、ボロスの兵士は祈りをつぶやく。神経を鎮めて精神を集中するのだ。 In the quiet before a battle, Boros soldiers whisper prayers that steady their nerves and focus their minds. ラヴニカのギルド 【M TG Wiki】 名前
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web https //www.hewasagod.com/ Instagram https //www.instagram.com/hewasagod/ member Kriz Dk ( Chris Densky ) (Genitorturers, Deadstar Assembly) TonyPellino (Adva) Ray Zvovushe Dan Perrone Benjamin Curns vocal MusicMuckraker Music Muckraker February 23rd 2024 1. Forward March 2. Pestilence 3. Track Marks 4. Two New Stars 5. Knight To Rook Three 6. The Great Divide 7. Escape Plan 8. Class Dismissed 9. Game Of Pretend 10. Incarnadine 11. Blood On Our Hands Produced by Tony Pellino Mixed and mastered by Ryan Boesch at Candor Recording, Tampa, FL Engineered by Tony Pellino Assistant drum engineering by Chris Densky Artwork by Luca Solo Macello